白癜风专家李从悠 https://m-mip.39.net/disease/mipso_5466841.html图文章截图近日，医院的云径平教授团队在肝脏病学顶级期刊《journalofhepatology》（IF=20.,JCR一区）发表文章《Clinicopathologicfeatures,tumorimmunemicroenvironmentandgenomiclandscapeofEpstein-Barrvirus-associatedintrahepaticcholangiocarcinoma》，该文章主要是对爱泼斯坦-巴尔病毒相关性肝内胆管癌的临床病理特征、肿瘤微环境和基因组学特征进行分析。文章主要从下图三个部分对爱泼斯坦-巴尔病毒相关性肝内胆管癌（EBValCC）的各项特征进行解析。其中，基迪奥生物为该项目提供了外显子测序以及个性化生物信息分析服务（对应文章的第三个部分——肿瘤基因组学特征分析），用高质量的生物信息和优质的售后服务，保障客户高水平文章发表。图2文章主要结构文章主要相关缩写：EBV（爱泼斯坦-巴尔病毒），ICC（肝内胆管癌），EBVaICC（EBV相关的肝内胆管癌），nonEBVaICC（非EBV相关肝内胆管癌），LEL亚型（淋巴上皮瘤样亚型），CT（传统型），TILs（肿瘤浸润淋巴细胞），TIME（肿瘤微环境），TMIT（肿瘤环境免疫类型）。文章背景：爱泼斯坦巴尔病毒（EBV）是一种疱疹病毒，主要引起急性传染性单核细胞增多症。EBV影响非常广泛，全世界90%以上的人口受到了其感染，但后果却截然不同。虽然这种感染通常不会影响人类，但在某些情况下，它会导致腺热或各种癌症。不同的EBV病毒株会导致不同的病程。EBV引起的疾病通常有区域差异：腺热主要发生在欧洲和北美，通常影响青少年或年轻人。在赤道非洲，伯基特淋巴瘤与EBV感染有关。在中国南部地区，以及东南亚，这种病毒经常导致鼻咽癌、鼻癌和喉癌，但也会导致其他类型的肿瘤，比如云教授这篇文章主要解析EBV导致的肝内胆管癌的特征。材料和方法：例原发型ICC肿瘤样本，进行免疫组化、免疫荧光、荧光原位杂交等指标检测。另外，从中挑选了0对癌-癌旁样本进行00X外显子测序。文章主要内容解析：一、EBVaICC临床病理特征（）在6.6%（20/）原发性ICC中检测到EBV感染，这20例被定义为EBVaICC。但EBV病毒在邻近肿瘤的周围非肿瘤性胆管上皮中不存在。这说明病毒的感染发生在细胞癌变前。（2）EBVaICC患者的临床特征，统计指标包括年龄、性别分布，肿瘤分期，以及乙肝、肝硬化的患病率等。（3）EBVaICC的形态学和免疫表型主要通过组织切片观察、免疫组化、原位杂交等，对肿瘤进行分型，比如45%（9/20）被鉴定为淋巴上皮瘤样亚型（LEL）以及55%（/20）被鉴定为传统型（CT）。其他检测的指标包括常见的免疫组化指标，例如胆汁型细胞角蛋白（CK7，CK9）等的数据进行了汇总。（4）EBValCC与nonEBValCC的临床病理特征比较主要对两类ICC亚型的病理特征指标进行了比较。比如，发现LEL亚型几乎只出现在EBVaICC里（下图最后一个柱形图）。图3EBVaICC与nonEBValCC各项指标的对比（5）EBValCC的预后特征CT亚型的EBValCC与nonEBValCC没有显著区别，而LEL亚型的EBValCC的预后显著更好（生存期更长）。图4ICC各个亚型的预后比较二、EBVaICC肿瘤微环境分析（)EBVaICC中的肿瘤浸性润淋巴细胞（TILs）数量统计基于免疫组化的结果，利用数字病理扫描仪统计肿瘤样本中对各类型的TILs的比例。相比nonEBValCC，EBValICC中多种TILs的密度显著增加，包括CD20+B细胞、CD3+T细胞、CD68+TAMs、CD8+T细胞、FoxP3+T细胞、CTLA-4+T细胞等。CD20+B和CD8+T细胞密度增高的样本，会有更好的治疗预后。备注：这个部分没有开展单细胞测序，是这篇文章非常遗憾的地方。在讨论部分，我们会展开讲这个问题。图5EBVaICC中多种TILs密度升高（2)EBV阳性与PD-、PD-L阳性的关系免疫组化的结果表明，EBVaICC肿瘤样本有更大比例在PD和PDL呈现阳性。这表明，EBVaICC在PD靶向免疫治疗上有很大潜力。（3）EBV阳性与TMIT（肿瘤环境免疫类型）的关系根据PDL和CD8两个蛋白的免疫组化结果，作者将ICC样本的TMIT分为四种类型（I型、II型、III型和IV型），不同类型的预后之间存在显著差异。90%(8/20)的EBVaICC属于TMITI型，对应的nonEBVaICC仅有2.4%(35/)属于TMITI型。说明EBV阳性与ICC的TMIT分型有显著的相关性。这说明EBV的感染导致的ICC有特殊的肿瘤微环境（这可能与机体对病毒的免疫应答有关）。而免疫环境的变化，会影响该肿瘤的预后（预后更好）。文章还另外举了一个例子，4号病例对联合治疗（包括免疫检查点抑制剂治疗）表现出良好的治疗效果，存活时间长达84个月。相比另外两种感染（乙肝病毒和肝吸虫）导致的ICC，EBVaICC体现出不同的肿瘤微环境（更高的淋巴细胞浸润以及更高的PDL表达）。这说明对于不同感染导致ICC，机体产生的免疫反应不同，从而影响肿瘤微环境，对应的治疗策略和预后也会不同。图6ICC的TMIT分型以及预后的比较三、基因组学特征分析文章这个部分的内容是在基迪奥完成外显子测序和生物信息分析，主要对肿瘤中常见的三类体细胞突变进行汇总和讨论，另外也对样本中分离的EBV病毒进行了测序和分析。外显子测序会发现大量突变，但大部分突变是没有生物学意义的。对于肿瘤研究，就需要通过体细胞突变分析、驱动基因分析等，结合突变注释和基因注释，来一步步缩小目标基因的范围。虽然最终放在文章中的仅仅是少量图表，但实际上需要进行反复多次的个性化挖掘以及定制化图表的优化。（）体细胞突变分析（SNP/indel）通过对0对EBVaICCs癌和癌旁样本的00X外显子测序，发现了个体细胞SNP和indel体细胞突变。SNP包括个非沉默突变和个沉默突变，显示出高突变率（中位数:4.4个突变/Mb）。发现至少有三名患者的7个基因受到非沉默突变的影响，包括MUC4，DNAH，GLI2,LIPE，MYH7，RP-F4.2和WDR36。主要的体细胞突变类型是C:GT：A转换和C:GA:T转换。此外，利用MuSigCV软件预测了EBVaICC中的22个潜在驱动基因（图7）。值得注意的是，与其他EBV导致的肿瘤相比（包括胃癌、鼻咽癌），EBVaICC显示出不同的突变模式。这说明虽然这些肿瘤都来自EBV感染，但癌基因的驱动机制并不相同（或许治疗策略也要不同）。图7EBVaICC的SNP/indel体细胞突变。(A)每个EBVaICC样本的体细胞突变基因数。(B)EBVaICC中频繁突变的基因(至少在三个样本中鉴定)。(C)根据样本列出临床病理特征。(D)每个EBVaICC样本的主要体细胞突变类型。(E)图中显示了由MuSigCV算法识别的22个潜在驱动基因，x轴显示突变类型，y轴显示估计的突变。（2)体细胞突变之CNV突变分析比较高频的拷贝数丢失包括染色体7q34(频率30%)和4q.2(频率50%)的丢失。没有发现染色体臂级别的拷贝数增加。缺失基因中，PRSS缺失（三个病例中发现）被报道是胰腺炎的致病原因。对CNV相关基因的通路也进行了Kegg富集分析。（3）体细胞突变之SV分析通过FISH实验发现了FGFR2基因的融合，但通过novoBreak算法并没有在外显子测序数据中发现该融合突变。（4）病毒基因组突变分析作者也从样本中分离了EBV病毒株，并进行测序和组装。在肿瘤样本的EBV的基因组数据中频率排名前40的非同步突变见下图。所有病例的EBV病毒都在BKRF4（H7N），BcRF（T33A），BKRF4（G69V），BOLF（D54E）和BPLF（SG）等基因存在突变。图8所有病例EBV病毒的高频突变基因讨论这是一篇偏向疾病临床特征解析的文章。这篇文章对EBV相关的肝内胆管癌（EBVaICC）的各方面特征进行了系统的解析报道。从文章研究结果看，EBVaICC在病人临床病例特性、肿瘤微环境以及肿瘤基因组上，与其他类型的ICC存在显著差异。这无疑对后续该种类型的肿瘤的研究和个性化治疗提供了很好的指南。图9文章主要研究思路以及潜在可以后续深入方向——单细胞测序该项目由于新鲜组织标本中的RNA质量差，无法完成转录组测序，所以在基因表达调控分析方面有所缺失。在后续的研究中，无疑可以继续补充包括转录组在内的多组学数据。但实际上也可以更近一步，后续研究中可以不仅仅拘泥于常规组学，单细胞测序无疑是具吸引力的方向。在本文中肿瘤微环境分析的部分，由于受限于只有免疫组化的信息，所以相关分析讨论只能浅尝辄止，很多问题并没有被回答。我作为外行，看完了文章还会有不少疑问（尽管也许问题很业余）。例如，EBV病毒侵染机体，本身会激发免疫反应，导致单核细胞增多症。那么EBVaICC中肿瘤浸润性淋巴细胞与单纯EBV感染应答产生的效应淋巴细胞有什么差异？EBVaICC中，肿瘤浸润性淋巴细胞比例升高是否与机体对病毒的免疫反应有关？EBVaICC与nonEBVaICC中的肿瘤浸润性淋巴细胞有什么区别？这些都是非常有意思的问题。那么这篇文章如果引入单细胞测序，就可以良好回答以上的疑问。可以设想进行这样的实验设计：取EBVaICC，nonEBVaICC以及EBV感染但没有发生癌变的肝内胆管(例如来自EBV感染导致肝硬化但没有发生癌变的样本)这三类样本进行单细胞转录组以及V(D)J免疫组测序。通过不同类型样本间淋巴细胞的比较，就可以很好回答我以上提出的几点疑问。如果这篇文章能够引入单细胞转录组测序，无疑会进一步提升文章的吸引力（当然就有机会冲击更好的期刊）。图0如果这篇文章引入单细胞测序可以设想这样设计将临床研究与单细胞测序结合，从而对疾病的发生和治疗机制进行更深入的解析，目前已经是医学临床研究热门的方向。在年和年，基迪奥合作客户先后在cell发表两篇文章，都采用了这样的思路，以下是这两篇文章解析的链接，供大家借鉴。往期文章：基迪奥客户文章：0X单细胞转录组+免疫组发文《Cell》基迪奥客户研究成果再登《Cell》参考文献：Huang,Yu-Hua,etal."Clinicopathologicfeatures,tumorimmunemicroenvironmentandgenomiclandscapeofEpstein-Barrvirus-associatedintrahepaticcholangiocarcinoma."JournalofHepatology().
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