恶性实体肿瘤的共同特征是具有瘤内异质性(intratumorheterogeneityITH)，这是一个与肿瘤侵袭性相关的普遍特征，也被认为是进化选择的结果。因为它能够增加肿瘤细胞的适应性和存活率。最近的单细胞分析以及文献中的许多研究表明，肿瘤侵袭性和ITH之间存在紧密联系。因此，ITH的存在给靶向治疗带来了的挑战，导致耐药性以及治疗失败。研究者提出:是什么样的细胞因素驱动着肿瘤细胞的集体行为？是否存在调节肿瘤细胞进化的内在驱动因素。原发性肝癌是世界上最致命的五大癌症之一，其中最常见的类型是肝细胞癌(HCC)和肝内胆管癌(iCCA)。两种肿瘤类型都显示出广泛的瘤间和瘤内异质性。因此本研究试图通过对肝癌患者的肿瘤单细胞转录组分析来确定肿瘤细胞进化的驱动因素。
研究设计
作者分析了来自NIH临床中心37名患者的46例肝细胞癌(HCC)和肝胆囊癌(iCCA)活检样本，从7名患者的治疗前后收集了16例活检样本进行单细胞RNA测序。并开发了一种基于机器学习的新型共识聚类方法，该方法可追踪个恶性和非恶性细胞的细胞状态，包括基于肿瘤细胞转录的功能克隆分析。作者另外还研究了4名患者的纵向样本，以确定肿瘤细胞状态及其演变。并且在来自名HCC患者和名iCCA患者的批量转录数据中得到验证。
研究结果
1.肝癌患者肿瘤内单细胞图谱
研究者对7名肝癌患者治疗前后的16个活检样本进行单细胞RNA测序。以研究肿瘤细胞状态、细胞层次及其演变对ITH的影响(图1A)。获得了个单细胞的转录谱(图1B)。结果显示患者(H34)在不同时间点收集的三份活检样本，其肿瘤内如T细胞、B细胞、肿瘤相关成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关内皮细胞和上皮细胞，组成相似。表明在肿瘤内随着时间的推移肿瘤基质成分是相对稳定的(图1D)，之后鉴定出个恶性细胞。这些恶性细胞形成了患者特有的集群，每个集群都有不同的群体(图1E，上图)。成对性分析表明，瘤内细胞之间的联系比肿瘤之间更强(图1E，下图)。非恶性细胞主要根据细胞类型分组，如根据已知的细胞谱系特异性标记基因注释的T细胞、B细胞、CAFs、TAMs、tec、肝细胞和胆管细胞(图1F)。之后通过组织病理学分析证实了肝脏肿瘤的组织学(图1G)。
图1原发性肝癌的单细胞转录分析
2.肿瘤细胞功能克隆性与肿瘤分支进化
之后作者通过开发的一种聚类算法，将肿瘤细胞状态确定为每个肿瘤内恶性细胞的功能克隆性。再基于层次聚类方法分析肿瘤子聚类之间的相似性(图2A)。在系统发育树中发现了三个主要分支，并使用分支指数(BI)将这些分支称为BI-A、BI-B和BI-C。BI-A中的所有肿瘤都来自HCC病例，而BI-B和BI-C包含来自HCC和iCCA的肿瘤。为了进一步确定肿瘤内的簇与簇之间的关系，研究者分析了恶性细胞中的单细胞轨迹和潜在细胞谱系(图2A)。揭示了肿瘤细胞轨迹。并开发了一种算法来搜索不同分支的保守基因(图2B)。并揭示了SPP1是BI-B和BI-C中最保守的基因，发现SPP1的表达通常在肿瘤细胞中富集(图2A，第6行)，并且在BI-B/C中比BI-A高得多(图2A，下图)。此外，SPP1主要表达于恶性细胞而非非恶性细胞(图2C)。因此表明SPP1可以作为肿瘤进化的驱动力。
图2肿瘤细胞功能克隆和肿瘤分支进化
3.肿瘤功能克隆性与患者预后相关
肿瘤簇数与患者的生存期关联度分析发现，肿瘤簇数较高的患者比簇数较低的患者生存期短得多(图3A)。此外，BI-BC组患者的生存期显著短于BI-A组患者(图3C)。研究者还分别对HCC患者进行了生存分析，发现了类似的结果(图3D)。之后作者对肿瘤内功能簇之间的差异表达基因进行富集分析，发现BI-B和BI-C中的肿瘤富含肿瘤侵袭性相关通路，如上皮-间质转化(EMT)、缺氧、TNF信号传导以及糖酵解(图3E)。与BI-A相比，由GSEA定义的与缺氧、EMT和血管生成相关的基因在BI-B和BI-C中升高(图3F，前三组)。此外，这些基因在肿瘤内的子簇中异源表达，表明不同的簇可能在肿瘤生态系统中扮演不同的角色(图3F，底部三个图)。这些结果与上述生存分析一致，表明BI-B和BI-C组的患者倾向于获得侵袭性肿瘤特征。之后研究者在名患者的两个HCC队列(即肝癌研究所、LCI队列和TCGAHCC队列)和名患者的两个iCCA队列的大量转录组数据中进行验证，并且从四个队列中获得了一致的结果。综上结果表明肿瘤功能克隆性与患者预后相关，与肿瘤类型无关。
图3肿瘤细胞状态异质性与患者预后相关
4.TME极化
当分别分析T细胞、B细胞、TAMs、CAFs和tec时，发现这些细胞在BI-A和BI-BC之间的转录谱不同，表明恶性细胞对非恶性细胞的潜在重编程。由于患者均接受了免疫检查点抑制剂的治疗，因此研究者主要
